黄绵马酸BB联合红霉素抑制表皮葡萄球菌及其生物被膜的形成研究

  • 时间:2022-05-13 01:21  来源:未知   作者:admin   点击:

  皮肤及软组织感染(skin and soft tissue infections,SSTI)是临床十分常见的疾病。根据SSTI的流行病学统计的结果可知,SSTI致病菌以葡萄球菌最多[1],其中表皮葡萄球菌为主要致病菌之一。随着广谱抗菌药物在临床的广泛应用,SSTI的耐药性持续上升,大大提高了临床疾病的难愈性和治疗成本。而红霉素(erythromycin)、莫匹罗星等抗生素作为治疗皮肤和浅表外伤感染的局部外用抗菌药物,其耐药菌株逐渐增加[2]。细菌耐药的主要原因之一是病原体能够形成难以清除的生物被膜,使得药物不能有效治疗其导致的相关感染[3]。生物被膜大多数被定义为一种细胞微生物群落,其嵌在胞外聚合物质的基质中,具有稳定结构和特定功能,是微生物适应环境生存的一种生存模式。生物被膜的形成过程可分为4个阶段,主要为初黏附阶段、菌落聚集形成阶段、生物被膜成熟阶段及生物被膜脱落阶段。研究发现,处于生物被膜内的细菌与浮游菌相比,其耐药性提高10~1000倍[4]。目前,生物被膜抑制剂是目前国外抗生素研究的一个新方向,抗生素与生物被膜抑制剂联合应用,可以减少用药量,提高临床治疗效果[5]。因此,寻找生物被膜抑制剂作为新药研发具有重要意义。

  香鳞毛蕨Dryopteris fragrans (L.) Schott. 为鳞毛蕨科鳞毛蕨属植物,民间常被用于治疗各种皮肤疾病,如牛皮癣、皮炎和皮疹。根据药理学研究,香鳞毛蕨具有抗菌、抗过敏、抗关节炎、抗肿瘤、抗氧化等多种药理活性[6],尤其抗菌活性显著,且发挥该作用的主要成分为间苯三酚类化合物。研究显示,香鳞毛蕨中所含的间苯三酚类化合物黄绵马酸BB具有良好的抗菌活性[7]。然而,有关黄绵马酸BB联合抗生素的抗菌活性以及对生物被膜的抑制作用尚未见报道。本研究通过测定黄绵马酸BB联用抗生素对耐药和敏感表皮葡萄球菌的抑菌活性及对其生物被膜的抑制作用,为黄绵马酸BB开发成为一种新型的抗菌药物提供理论基础。

  SW-CJ-1F超净工作台(苏净集团安泰公司);iMark酶标仪(美国BIO-RAD公司);Memmert恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司);BKQ-Z301立式压力蒸汽灭菌锅(山东博科消毒设备有限公司);CHA-S恒温振荡器(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司);JSM-7610F Plus场发射扫描电子显微镜(日本电子株式会社)。

  表皮葡萄球菌临床分离菌株(Staphylococcus epidermidis),共11株(SE01~SE11),由广东莱恩医药研究院有限公司赠予;金黄色葡萄球菌质控菌株(Staphylococcus aureus,)购自广东省微生物菌种保藏中心。

  2.1.1 最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)的测定 根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)[8]制定的M07-A9方案进行微量稀释法测定黄绵马酸BB与红霉素分别对11株表皮葡萄球菌(SE01~SE11)的MIC值,参考Ko等[9]的方法,将黄绵马酸BB和红霉素在96微孔板中进行二倍稀释至终质量浓度为5120、2560、1280、640、320、160、80、40、20、10 μg/mL,每孔含100 µL药液。于各孔中添加100 µL经CAMHB培养基稀释的1×106 CFU/mL菌悬液。同时设置只含200 μL菌悬液的生长对照组及只含200 μL培养基的空白对照组。于35 ℃恒温静置培养18~24 h后,与生长对照组对比,以肉眼观察无受试细菌生长的相应药物浓度为MIC。

  根据CLSI制定的M07-A11方案,在进行药敏实验时需对实验过程及环境进行质量控制实验,以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,)作为质控(quality control,QC)菌株,头孢唑啉为质控药物。平行操作条件下,QC菌株的MIC在0.25~1.00 µg/mL,则认定测定结果有效可信。

  2.1.2 联合用药的部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration idex,FICI)的测定 参考Manalo等[10]的方法并稍作修改,用CAMHB培养基将黄绵马酸BB和红霉素分别进行梯度浓度稀释,分别取50 µL药液接种于96微孔板中,各孔再加入100 µL实验菌悬液(1.0×106 CFU/mL)。最终在96微孔板中,每一行包含梯度浓度递减的黄绵马酸BB(4 MIC~1/16 MIC),每一列含有梯度浓度递减的红霉素(4 MIC~1/16 MIC),同时设置只含菌液的生长对照组及只含培养基的空白对照组。于35 ℃恒温培养箱中静置培养18~24 h后,与生长对照孔对比,以肉眼观察无受试菌生长的相应药物浓度为其MIC值,并根据MIC值计算FICI。

  结果评价标准[11]:以FICI值作为联合用药敏感实验的判断依据,FICI≤0.5为协同作用;0.5<FICI≤1.0为相加作用;1<FICI≤2为无关作用;FICI>2为拮抗作用。

  参考文献方法[12]采用活菌计数法,黄绵马酸BB和红霉素分别稀释为MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC共4个浓度,每个浓度相互联合进行杀菌曲线的绘制。不同浓度的药物以及不同组合浓度的药物加至含1×106 CFU/mL菌液浓度的CAMHB培养基中,同时设置只含菌液的生长对照组。35 ℃恒温震荡培养,分别在0、2、4、6、8、12、24、48 h取出,采用平板稀释涂布法计算活菌数。绘制受试菌的时间杀菌曲线 黄绵马酸BB和红霉素抗生物被膜活性的测定

  将菌悬液(1×106 CFU/mL)接种于96微孔板中,35 ℃下恒温静置培养24 h后,除去各孔培养基和浮游菌,使用无菌PBS冲洗孔内形成的生物被膜。使用TSB培养基对药物进行梯度稀释,黄绵马酸BB单药组为1280~5 μg/mL,红霉素单药组为2560~10 μg/mL,联合用药组按照“2.1.2”项方法进行药物稀释与组合。各组药物分别取200 μL加至生物被膜,置于35 ℃恒温培养箱继续培养24 h,观察结果。同时设置生长对照组及空白对照组。

  根据“2.3”项测定的MBIC结果,确定最佳单药浓度和联合用药浓度。采用XTT比色法、半定量黏附实验和扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)共同评价药物对受试菌株生物被膜的清除作用。

  2.4.1 XTT比色法测定黄绵马酸BB联合红霉素对受试菌株生物被膜内细菌代谢活性的影响 含1×106 CFU/mL菌液浓度的TSB培养基接种于96微孔板中,在35 ℃下孵育6、24、48 h。于相应的时间段,弃去各孔培养基和浮游菌,进行PBS冲洗。SE04菌株加入20 μg/mL黄绵马酸BB与20 μg/mL红霉素,SE08菌株加入20 μg/mL黄绵马酸BB与0.04 μg/mL红霉素,各200 μL,继续培养24 h,各孔加100 μL XTT(0.5 mg/mL)/Vit.K3(10 mmol/L)混合液试剂,35 ℃避光孵育2 h后,测定450 nm吸光度(A450)值。同时设置生长对照组及空白对照组。

  2.4.2 半定量黏附实验测定黄绵马酸BB联合红霉素对受试菌株生物被膜总量的影响 按“2.4.1”项方法建立给药和不给药的6、24、48 h生物被膜,甲醇固定30 min后弃去,加入0.1%结晶紫染液,染色15 min后洗去未黏附染料,并采用95%乙醇溶解染料,测定570 nm吸光度(A570)值,即为生物被膜总量。

  2.4.3 SEM观察黄绵马酸BB联合红霉素对受试菌株生物被膜微观结构的影响 参考Schneider等[14]的方法,在含14 mm无菌圆玻片的24微孔板上分别构建6、24、48 h的生物被膜,并按照“2.4.1”项进行药物干预。2.5%戊二醛固定生物被膜过夜后,使用梯度浓度(30%、50%、70%、80%、90%、95%)乙醇进行梯度洗脱,各梯度浓度共洗脱2次,每次15 min,随后使用100%乙醇脱水2次,每次30 min。加入100%叔丁醇置换乙醇2次,每次30 min。冷冻真空干燥脱水样品,进行喷金处理,置于扫描电镜中观察。同时设置生长对照组。

  按“2.4.1”项方法建立给药或不给药的6、24、48 h生物被膜,按照制造商的规程使用Trizol试剂提取mRNA。随机取5例RNA样品1 μL,用凝胶成像系统观察总RNA的5S rRNA、18S rRNA和28S rRNA条带,若3条条带完整即可证明总RNA抽提比较完整。然后使用Prime TMRT reagent Kit试剂盒进行逆转录反应。最后,采用SYBR Premix EX Taq Ⅱ Kit试剂盒配制反应体系进行qRT-PCR检测。qRT-PCR的数据结果以16S rRNA为内参基因采用相对表达量2−∆∆Ct法进行分析。mRNA引物由上海生工生物技术有限公司合成,引物序列见表1。

  使用软件GraphPad Prism software version 8.0对数据进行统计学分析,采用单因素方差分析法,遵循t检验,P<0.05表示差异具有统计学意义。

  如表2所示,黄绵马酸BB与红霉素联合用药对11株受试菌株的FICI值范围为(0.51±0.00)~(0.75±0.05),均在0.5~1.0的区间内,说明黄绵马酸BB可增强红霉素对表皮葡萄球菌的抑制作用,表现为相加作用。黄绵马酸BB和红霉素对菌株SE04单独用药的MIC分别为45.91 µg/mL和128.00 µg/mL,联合用药后分别降至14.00 µg/mL和22.00 µg/mL;对于菌株SE08,黄绵马酸BB和红霉素单独用药的MIC分别为40.00 µg/mL和0.31 µg/mL,联合用药后二者分别降至13.33 µg/mL和0.16 µg/mL。因此根据各单药组的MIC值以及联合用药后的FICI值,选择1株对红霉素耐药且联合效果较好的菌株(SE04)以及1株对红霉素敏感且联合效果较好的菌株(SE08)进行后续实验。

  3.2 黄绵马酸BB联合红霉素对受试菌株时间杀菌曲线-A、B所示,菌株SE04的生长对照组4 h后进入对数生长期,24 h后进入成熟期,此后菌落数趋于平缓;黄绵马酸BB组和红霉素组在0~4 h菌落数持续下降,对菌落生长均有较好杀灭作用,12 h后菌落数在逐渐上升,表明杀菌作用逐渐减弱,48 h时菌落数基本趋于平衡,对比生长对照组的菌落数量均有轻微的下降。

  联合用药后的杀菌作用较各单药组好,其中1/2B+E组在24 h内有较好的抑制作用,较最有效的1/2 MIC两单药组菌落数下降了1~2 lgCFU,根据文献评价标准[15],药物联用组菌落计数较最有效的单药组减少≥2 lgCFU,定义为协同作用;药物联用组菌落计数较最有效的单药组减少1~2 lgCFU,定义为相加作用。因此,表明黄绵马酸BB联合红霉素抑制SE04菌株呈相加作用。

  SE08菌株的时间-杀菌曲线-C、D所示,生长对照组于6 h后进入对数生长期,24 h后进入成熟期,此后菌落数趋于平缓。黄绵马酸BB组在0~4 h菌落数呈下降趋势,在6~48 h时菌落数量总体呈上升趋势,提示其杀菌作用随时间逐渐减弱。红霉素组在0~24 h菌落数缓慢持续的上升,到达48 h时菌落数量达到最大。与生长对照组比较,各单药组的菌落数量均有轻微下降。联合用药后整体的杀菌作用优于各单药组,其中联合用药组中1/2B+E的抑菌作用最佳,较最有效的单药组菌落数下降了1~2 lgCFU,表明黄绵马酸BB联合红霉素抑制SE08菌株呈相加作用。

  SE04与SE08菌株的时间-杀菌曲线相比较可发现,联合用药后SE04菌株的对数生长期延迟至12 h,成熟期延至24 h;SE08菌株的对数生长期延迟至12 h,48 h内未出现成熟期。提示黄绵马酸BB联合红霉素对耐药或敏感菌株均具有延迟其生长的作用,尤其对敏感菌株SE08的抑制作用更为明显。

  结果如表3所示,黄绵马酸BB和红霉素联合用药后,对受试菌株SE04和SE08的生物被膜的FICI值分别为0.19±0.00和0.14±0.00,均呈协同效应。并根据联合用药的MBIC值,确定对受试菌株SE04的最佳联用药物干预质量浓度为20 μg/mL黄绵马酸BB与20 μg/mL红霉素,对SE08菌株的最佳联用药物干预质量浓度为20 μg/mL黄绵马酸BB与0.04 μg/mL红霉素,后续实验以此质量浓度进行。

  3.4.1 黄绵马酸BB联合红霉素对受试菌株生物被膜内细菌代谢活性的影响 如图2-A~C所示,联合用药组各阶段生物被膜内细菌的代谢活性均显著低于生长对照组(P<0.001)和各单药组(P<0.05、0.001)。可见黄绵马酸BB与红霉素联用后可有效抑制SE04菌株生物被膜形成各阶段的膜内细菌代谢活性,且比2种药物单独使用的效果好。

  如图2-D~F所示,相较于生长对照组,联合用药组在各阶段均能有效降低生物被膜内细菌的代谢活性(P<0.001);在黏附阶段,联合用药组的效果优于红霉素组(P<0.01);在聚集和成熟阶段,联合用药组的作用效果均优于各单药组(P<0.05、0.01、0.001)。可见黄绵马酸BB与红霉素联用后可有效抑制SE08菌株生物被膜形成各阶段的膜内细菌代谢活性,且效果优于2种药物单独使用。

  SE04与SE08菌株对比发现,分别与两单药组比较,联合用药对耐药菌株SE04的膜内细菌代谢活性的抑制作用优势阶段主要体现在黏附与聚集期,敏感菌株SE08则在聚集与成熟期。

  3.4.2 黄绵马酸BB联合红霉素对受试菌株生物被膜总量的影响 如图3所示,联合用药组在SE04与SE08菌株各阶段均可有效抑制生物被膜的形成,且效果均显著优于生长对照组(P<0.001)和各单药组(P<0.05、0.01、0.001)。可见黄绵马酸BB与红霉素联用后可有效抑制SE04与SE08菌株各阶段生物被膜的形成,且比2种药物单独使用的效果好。随着生物被膜逐渐形成,联合用药对耐药菌株SE04和敏感菌株SE08生物被膜总量的清除作用均逐渐降低。

  3.4.3 SEM观察受试菌株生物被膜微观结构的变化 如图4、5所示,生长对照组在黏附阶段(6 h)呈正常卵圆状,大小均一且光滑,且细菌逐渐开始相互黏附成团。与生长对照组相比,黄绵马酸BB作用后,细菌量相对减少,细菌之间黏连减少;红霉素作用后无明显变化;联合用药组细菌量大幅度下降,细菌形态轻微变形,可观察到菌体破裂。在聚集阶段(24 h),生长对照组微菌落相互聚集,胞间连接紧密,形成片状生物被膜。与生长对照组相比,黄绵马酸BB作用后,菌体部分破裂皱缩,仍可见胞外聚合物包裹在菌体外部;红霉素作用后效果不明显;联合用药组细菌量大幅度减少,细菌之间黏附较松散,可见少量细胞内容物渗出,生物被膜结构瓦解,菌体变形皱缩。在成熟阶段(48 h),生长对照组已经形成完整复杂的成熟生物被膜,细菌间连接紧密成簇状;各单药组膜内细菌形态结构完整;联合用药组细菌量大幅度下降,细菌之间黏连不成片,生物被膜结构趋向瓦解,细菌呈皱缩、凹陷等状态。

  总体而言,黄绵马酸BB与红霉素联合用药对SE04和SE08菌株均表现出较好的生物被膜清除作用,且总体上优于两单药组。尤其在聚集与成熟期,联合用药对敏感菌株SE08的清除作用优于耐药菌株SE04。

  如图6所示,在耐药菌株SE04的黏附和聚集阶段,与红霉素组相比,联合用药组可显著下调aap及sarA表达并上调agrA的表达(P<0.05、0.001)。且联合用药后对生物被膜形成各阶段的agrA基因和黏附阶段的aap基因的表达的影响均显著高于两单药组,具有统计学差异(P<0.001)。

  如图7所示,与生长对照组相比,在敏感菌株SE08生物被膜形成的各阶段,联合用药组均可显著下调aap、sarA的表达(P<0.01、0.001),同时在黏附阶段显著上调agrA的表达(P<0.001)。其中,联合用药组对生物被膜形成各阶段的sarA、agrA基因和黏附及聚集阶段的aap基因表达的影响显著高于黄绵马酸BB组或红霉素组(P<0.05、0.01、0.001)。

  结合图6与图7发现,SE04和SE08菌株的各给药组在各个阶段均有效抑制aap表达,且两株受试菌联合用药组均在黏附期对aap表达的下调作用显著优于单药组;对于SE04和SE08菌株,黄绵马酸BB在生物被膜形成聚集期对agrA均表现明显的上调作用。联合用药组对SE04菌株生物被膜形成各阶段agrA表达均呈显著上调作用,对SE08菌株仅表现在黏附阶段;联合用药组对SE08菌株生物被膜形成各阶段sarA的表达均呈显著抑制作用,对SE04菌株仅表现在黏附期。总而言之,说明联合用药对耐药和敏感受试菌aap基因的调节作用规律基本一致,且对耐药菌株SE04的agrA调控作用相较敏感菌株SE08更持久,而对SE08菌株的sarA调控作用较SE04菌株更持久。

  已有研究发现,红霉素作为临床治疗常用抗生素,其在亚抑菌浓度条件下可诱导耐药表皮葡萄球菌产生生物被膜,从而增强细菌的耐药性[16]。因此,如何有效防止生物被膜的形成仍然是一个具有挑战性的问题。细菌生物被膜是一个由多种物质组成的复杂有机体,在生物被膜形成的过程中,存在多种基因表达相互调控,甚至受到群体感应系统的影响。研究表明,在细菌聚集形成微菌落时,发挥主要作用的是多糖胞间黏附素(polysaccharide intercellular adhesion,PIA),由ica操纵子介导。同时sarA是ica操纵子的转录激活子,其可以控制ica的表达影响PIA的形成,分泌胞外聚合物(extracellular polymeric substance,EPS)包裹细菌,从而控制生物被膜的形成[17]。此外,在细菌增殖及聚集的过程中,还存在着非PIA依赖形成生物被膜的途径。表皮葡萄球菌表面的相关聚集蛋白Aap是非PIA依赖途径的关键,是表皮葡萄球菌细胞壁上的蛋白黏附分子,由基因aap编码产生,可通过Zn依赖型机制介导细胞间相互黏附聚集,进而促进表皮葡萄球菌生物膜的形成[18];生物被膜到达成熟阶段后,群体感应系统被激活来调控生物被膜的进一步形成以及脱落。群体感应系统通过监测其群体密度来调节特定的基因表达,为菌体生长以及生物膜形成提供保障,还可以调控EPS的合成,介导细菌的黏附能力,影响生物膜的成熟与结构[19]。迄今为止,葡萄球菌属中主要被报道的群体感应系统有agr系统和LuxS系统。agrA为agr群体感应系统的反应调节剂,可激活系统的表达并调控RNAⅢ的表达和psmα/psmβ编码phenol-soluble modulins(PSMs),从而进一步调控生物被膜的形成。有研究表明,agr系统还能促进生物膜脱落及解离,并可以上调细菌蛋白酶和毒素,下调黏附素等[20]。结合本研究结果,说明黄绵马酸BB联合红霉素是通过抑制aap和sarA基因的表达,减少PIA生成和细菌相互聚集黏附。同时,通过上调群体感应相关基因agrA的表达,从而抑制生物被膜的形成。

  抗生素耐药菌株的出现一直是临床用药的一大难点。本研究通过XTT实验、半定量黏附实验结果发现,黄绵马酸BB与红霉素联合用药后耐药菌株生物被膜的各阶段代谢水平及生物被膜形成总量均显著降低,且随着生物被膜的逐渐成熟,其抑制效果逐渐减弱。结合SEM观察结果分析,导致这一结果的原因可能是由于成熟的生物被膜具有较紧密的三维结构,并且EPS为膜内细菌形成了一层扩散屏障,防止抗生素等有毒物质扩散至菌体内,因此更能耐受药物处理。同时,由SEM观察结果分析可得联合用药可有效降低细菌量、减少细菌之间的黏连及EPS的形成。此外,qRT-PCR实验结果表明,联合用药对耐药菌株的aap、agrA和sarA基因的表达均具明显调控作用。综上推断,黄绵马酸BB与红霉素联合用药对耐药表皮葡萄球菌生物被膜的作用机制可能是在生物被膜形成初期抑制细菌代谢活性,导致细菌活力降低,难以在表面进行黏附;在细菌聚集形成微菌落时,抑制PIA的生成,导致EPS的分泌量减少,减少细菌间的相互聚集和黏附,从而抑制生物被膜的形成;当微菌落逐渐扩大,生物被膜不断增厚到达成熟阶段后,药物较难穿透生物被膜作用于内部菌体,但仍可通过调控群体感应系统来促进生物膜的脱落及解离,从而达到清除生物被膜的作用。

  综上所述,黄绵马酸BB联合红霉素可以干扰表皮葡萄球菌生物被膜的形成,有效降低细菌对其抗生素的耐药性,达到减量增效的效果,为将黄绵马酸BB开发成为一种新型的生物被膜抑制剂提供了理论基础,也为抗菌药物的开发利用提供了更多的可能性。